¿Cuál podría ser el problema si las bandas no aparecen en Western Blot?

Responder:

Muchos…

Explicación:

Hay muchas razones por las que las bandas pueden no aparecer en un western blot. ¿Las combinaciones de muestra y anticuerpo han funcionado en el pasado?

A continuación hay algunos que puedo pensar en este momento que pueden hacer que no aparezcan bandas:

1. ¿Se transfirió la proteína del gel? Intenta teñir la membrana con algo como ponceau S o amido black para ver si las bandas están presentes. A veces, puede ver las bandas de proteínas en la membrana humedeciéndola y manteniéndola en ángulo con respecto a la luz.

2. ¿Está funcionando el anticuerpo primario? Esta es una prueba difícil y la única forma de hacerlo es incluir un control positivo en el que sepa que tiene presente la proteína de interés. Si tiene algo de la proteína de interés, puede intentar localizarla en la membrana de Western blot (es decir, no ejecuta el gel) y ver si obtiene un resultado si procesa la membrana como si fuera un western blot.

3. ¿El anticuerpo secundario reconoce el anticuerpo primario? Una vez más, una prueba difícil de probar. Casi la única prueba que puede hacer es la prueba puntual mencionada anteriormente en 2.

4. ¿Está funcionando el "sistema de detección"? Dependiendo del método de detección que esté utilizando, puede probar la aplicación de picos en algunos de los anticuerpos secundarios para ver si la solución de detección, y también el agente desencadenante / enzima en el anticuerpo secundario, funciona. Es decir, ¿puede desencadenar la reacción solo con el anticuerpo secundario?

Finalmente, podría ser tan simple como una de las soluciones utilizadas durante el sondeo de la trama que se está realizando incorrectamente. Por ejemplo, si la concentración de sal es incorrecta en el tampón, esto puede hacer que los anticuerpos se liberen de la mancha. Lo mismo sucedería si el pH de los tampones fuera incorrecto.

La causa "más extraña" de un Western blot que no funcionó fue lo que experimenté personalmente cuando cambiamos el proveedor de la leche en polvo que usamos para bloquear la membrana. El polvo del nuevo proveedor contenía una fosfotirosina fosfatasa que eliminó todos los grupos de fosfato que intentábamos detectar con nuestro anticuerpo anti-fosfotirosina.